Ekstraksi DNA IKAN (Metode TNES Buffer)

EKSTRAKSI DNA 

Ekstraksi DNA adalah salah satu kegiatan untuk mendapatkan whole genom (genom total) dari suatu individu. Ekstraksi DNA bertujuan untuk mengisolasi DNA yang kemudian dapat digunakan untuk kepentingan lainnya seperti identifikasi, koleksi, maupun yang lainnya. Ada beberapa teknik dalam melakukan ekstraksi DNA salah satunya adalah menggunakan metode TNES BUFFER. 

Berikut langkah-langkah dalam melakukan ekstraksi DNA menggunakan Metode TNES Buffer pada sample ikan :

gambar : centrifuge (Dokumentasi Pribadi)

Langkah-langkah dalam melakukan ektraksi genom adalah sebagai berikut :

1.    Memasukkan ± 100 mg jaringan (daging) kedalam tabung 1,5 ml

2.    Menambahkan 400 µl TNESU8 Buffer kedalam tabung.

3.    Tabung di vortex, kemudian di biarkan pada suhu kamar selama 24 jam.

4.    Menambahkan 20 µl Proteinase K

5.    Inkubasi pada suhu 37⁰C sambil di goyang selama 2 hari.

6.    Menambahkan 50 µl NaCl kemudian divortex perlahan

7.    Menambahkan 500 µl Phenol:Chlorofom (1:1)/ (P:C = 1:1 )

8.    Rotamix (20 rpm) dengan tangan selama 10 menit.

9.    Sentrifuge pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4⁰C

10. Ambil semua supernatan, kemudian masukkan ke dalam tabung 1,5 ml yang baru.

11. Menambahkan 300 µl Chlorofom : Isoamylalcohol (24:1)/ (C:I = 24: 1) dingin.

12. Rotamix (20 rpm) menggunakan tangan selama 10 menit.

13. Centrifuge pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4⁰C

14. Ambil semua superntan, kemudian masukkan ke dalam tabung 1,5 ml yang baru.

15. Tambahkan 1000 µl Ethanol 99-100% dalam keadaan dingin.

16. Goyang sampai rata

17. Centrifuge pada 5000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang (bila tidak tampak pelet ulangi lagu centrifuge pada 14.000 rpm selama 5 menit)

18. Buang semua superntannya (pelet DNA nya jangan sampai terbuang)

19. Tambhakan 800 µl Ethanol 70% (dingin) untuk mebersihkan

20. Centrifuge pada kecepatan 14.000 rpm, selama 1 menit pada suhu 4⁰C

21. Buang semua supernatam (tinggal pelet DNA)

22. Kringkan pelet DNA  didalam vacum dryer

23. Tambahkan 100 µl TE-Buffer (pH8)

24. Tambahkan 5 µl RNAse (stok 1 mg/ml)

25. Incubasi pada suhu 37⁰C selama 30 menit

26. Tambahkan 120 µl NaCl 2,5 M

27.  Campurkan sampai merata dengan menggoyangkan tube

28.  Inkubasi pada es (-20⁰C) selama 2 jam.

29. Centrifuge pada 14.000 rpm selama 5 menit pada suhu 0⁰C untuk mendapatkan pelet DNA.

30. Buang semua supernatan

31. Masukkan ethanol 70% sebanyak 800 µl dingin

32. Sentrifuge pada 14.000 rpm selama 5 menit pada suhu 0⁰C untuk mendapatkan pelet.

33. Buang semua supernatan (tinggal pelet DNA)

34. Keringkan pelet DNA pada vacum dryer

35. Tambahkan 40 µl TE-Buffer  (Ph 8) Kemudian Vortex.

36. Simpan pada suhu -20⁰C atau -40⁰C

Setelah melakukan proses ekstraksi, kita melakukan proses elektroforesis. Proses elektroforesis bertujuan untuk mengecek apakah hasil ekstraksi genom yang dilakukan berhasil atau tidak. Berhasil atau tidaknya dapat diketahui dengan adanya band pada gel setelah melakukan proses elektroforesis. Langkah-langkah dalam melakukan elektroforesis adalah sebagai berikut :

gambar : alat elektroforesis (Dokumentasi Pribadi)

a.    Membuat agar dengan konsentrasi 0,8 % dengan langkh-langkah sebagai berikut :

1.    Menimbang agarose sebanyak 0,48 gr

2.    Mengukukur larutan TBE sebanyak 60 ml

3.    Mencampurkan larutan TBE dengan agarose kemudian di masukkan kedalam oven 2 menit.

4.    Dibiarkan beberapa saat pada suhu kamar, kemudian di tuang kedalam cetakan agar elektroforesis.

5.    Cetakan elektroforesis yang digunakan dimodifikasi dengan menyatukan sisir pada cetakan agar sumur yang terbentuk berukuran besar.

6.    Di biarkan pada suhu kamar selama 35 menit.

b.    Meneteskan loadingdye dengan konsentrasi 6x sebanyak 5 µl kertas film.

c.    Meneteskan DNA hasil PCR ke loadingdye sebanyak 20µl kemudian mencampurkan sampai rata.

d.    Memasukkan hasil PCR yang telah dicampur loadingdye ke dalam ke dalam masing-masing sumur gel elektroforesis.

e.    Melakukan elektroforesis selama 30 menit.

f.     Agar yang telah dielektroforesis di warnai dengan merendamnya kedalam larutan Ethidium Bromide selama 35 menit.

g.    Kemudian dilakukan pemotretan untuk melihat apakah terdapat genomnya telah berhasil di ekstraksi atau tidak.

Setelah melakukan elektroforesis, kemudian kita melakukan pemotretan, berikut contoh hasil pemotretan :

Hasil elektroforesis.

Dari gambar yang diatas, nampak bahwa kita berhasil melakukan ekstraksi genom, itu terbukti dengan adanya pita (band) pada foto hasil elektroforesis dengan ukuran >10.000 bp, yang merupakan ukuran dari genom.

Semoga tulisan ini bermanfaat,